No início, Villegaignon mostrou-se simpático aos recém-chegados. Na ocasião da celebração da primeira Santa Ceia em terras brasileiras em 21 de março de 1557, chegou a confessar publicamente a sua fé na doutrina reformada Calvinista, todavia, logo começou a divergir dos reformados em relação a singela celebração da Ceia do Senhor e a outras diversas questões doutrinárias.

Segundo relatos históricos da época, Villegaignon tornou-se um tirano cruel. Passou a obrigar seus trabalhadores a efetuarem trabalhos forçados, privando-os de alimentação, descanso e vestuário adequados. Muitos de seus mordomos foram consumidos pela fome e doenças por sua negligência e omissão.
No final de outubro, expulsou-os da pequena ilha para o continente. Impossibilitados de dar continuidade ao seu trabalho, no início de 1558, eles retornaram para a pátria. Todavia, diante das condições precárias da embarcação, cinco dos calvinistas decidiram voltar à terra firme, Eram eles Jacques Le Balleur, Jean du Bourdel, Matthieu Verneuil, Pierre Bourdon e André la Fon. Segundo informações, Balleur conseguiu fugir da ilha, no entanto os demais foram até a presença de Villegaignon para pedir-lhe que os recebesse novamente.
Acusados pelo comandante de serem traidores e espiões, após tê-los açoitado, foram presos em uma cela estreita, escura, e com cadeias muito pesadas prendendo seus pés. Villegaignon possuía diversos instrumentos de tortura, os quais utilizava para castigar seus mordomos escravos e para afugentar os selvagens daquela região.

Ele planejava como executá-los, e por estar tomado de grande preocupação de como fazê-lo, constantemente visitava a cela onde os calvinistas estavam presos, pois a sua tirania tirava até mesmo a confiança que tinha em seus próprios mordomos, os quais colocou para fazer escolta dos presos naquela cela. Não se conformava com a atitude dos servos de Deus, pois apesar de estarem cientes de que poderiam a qualquer momento ser executados, alegravam-se na presença de Deus, e passavam o dia e a noite cantando louvores, recitando salmos e orando a Deus.
Por haver se declarado inimigo dos cristãos calvinistas, e sabendo que poderia agradar a corte com a morte dos reformados, resolveu interrogá-los sobre a fé reformada, a fim de condená-los por heresia. Foi quando formulou um questionário teológico, e lhes enviou a fim de respondê-lo, dando um prazo de apenas 12 horas para apresentarem as suas posições doutrinárias. Jean Du Bourdel foi escolhido para redigir o documento, que mais tarde ficou conhecida como a Declaração de Fé da Guanabara, a primeira declaração de fé das Américas. Era o mais velho dentre seus amigos, tinha profundo conhecimento bíblico, teológico, da história da igreja e da fé reformada.

Enquanto escrevia, Bourdel encorajava seus amigos a permanecerem inabaláveis contra as afrontas do diabo, da carne e do mundo, que tentavam através de toda sorte de artimanhas levá-los a negar a fé em Cristo. Ao concluir a declaração, a mesma foi lida pelos huguenotes e assinada pelos mesmos, e encaminhada a Villegaignon, que ao recebê-la indignou-se sobremaneira, mandando chamar um após outro a fim de confirmar o escrito e executá-los de forma sumária. Ao chegar ao conhecimento do povo as intenções de Villegaignon, alguns tentaram fazer os calvinistas desistirem da fé, o que levou Bourdel a fazer o seguinte pronunciamento:
“Meus irmãos, vejo que Satanás se esforça por todos os meios para nos impedir de, resolutamente, defendermos hoje a causa de Cristo Jesus Senhor nosso, e que alguns de nos revelam uma timidez fora do razoável, equivalente mesmo a uma duvida acerca do socorro e favor do nosso bom Deus, em cujas mãos, sabemos, estão nossas vidas, que ninguém nos poderá tirar sem as determinações dos seus sábios conselhos. Ora, eu vos peço que comigo considereis o modo e o motivo por que viemos a este pais: Quem nos moveu á travessia do oceano numa extensão de duas mil léguas? Quem nos preservou de tantos perigos? Acaso não foi aquele que tudo governa, que dirige todas as coisas pela sua bondade infinita, que ampara os seus por meios admiráveis? É certo que contra nós militam três inimigos poderosos : – o Mundo, o Diabo e a Carne, e que por nós mesmos não podemos resistir-lhes. Mas, si acorrermos ao Senhor Jesus, que os venceu por nós, ele nos assistirá consoante a sua promessa, que sempre cumpre, por isso que é fiel e Todo-Poderoso. Apeguemo-nos a ele, e nele inteiramente repousemos. Coragem, pois, meus irmãos! Que os enganos, que as crueldades, que as riquezas deste mundo não nos embaracem de irmos a Cristo!”